Dopo la laurea in Giurisprudenza, ottenuta per volontà dei genitori, assecondò ben presto la propria vocazione artistica iscrivendosi all'Accademia Nazionale d'Arte Drammatica Silvio D'Amico di Roma.

In teatro esordì nella stagione 1947-1948, al Piccolo Teatro di Roma sotto la direzione del suo maestro Orazio Costa, nella Compagnia di Vittorio Gassman ed Evi Maltagliati con Tino Buazzelli, recitando in testi perlopiù drammatici, in molti casi allestiti in prima assoluta per l'Italia.

Nella stagione 1948-1949 recitò al Piccolo Teatro di Milano, sotto la regia di Giorgio Strehler, nei drammi shakesperiani di Romeo e Giulietta, La Tempesta e Riccardo II insieme a grandi attori di prosa del calibro di Giorgio De Lullo, Edda Albertini e Lilla Brignone.

Nella stagione 1952-1953 collaborò col grande commediografo Eduardo De Filippo, portando in scena al Teatro Eliseo di Roma tre suoi atti unici, Amicizia, I morti non fanno paura e Il successo del giorno, recitandoli insieme con Paolo Panelli e Bice Valori.

Rientrato a Roma, insieme ai suoi compagni di studio Paolo Ferrari e Gianni Bonagura, formò un terzetto che si esibì con successo dapprima nei varietà radiofonici e quindi in molti spettacoli del teatro di rivista, e della commedia musicale, con Tre per tre... Nava di Marcello Marchesi, insieme alle tre sorelle Nava, quindi nella stagione 1954-1955 con Festival scritto da Age, Scarpelli, Marcello Marchesi, Dino Verde e Orio Vergani, e infine nella stagione 1956-1957 con Gli italiani sono fatti così di Vittorio Metz, Marcello Marchesi e Dino Verde, insieme alla coppia Billi-Riva e Wanda Osiris.

In quegli anni lavorò anche con Corrado.

I suoi due grandi trionfi sul palcoscenico li ottiene comunque più avanti, nelle commedie musicali Un trapezio per Lisistrata (1958) di Garinei e Giovannini accanto a Delia Scala, e soprattutto nel Rugantino (1963) di Pasquale Festa Campanile e Massimo Franciosa, insieme ad Aldo Fabrizi e Bice Valori, rimasta negli annali del teatro italiano come un' autentico trionfo

Sul grande schermo debuttò nel 1949 e per una decina di anni ricoprì ruoli di varia importanza in film assai modesti.

Si cimentò anche come doppiatore, prestando la propria voce tra gli altri a Robert Mitchum in Sette settimane di guai, Earl Holliman in Il pianeta proibito, quindi al francese Gérard Philipe e, tra gli italiani, Franco Fabrizi in I vitelloni di Federico Fellini, Sergio Raimondi in Piccola posta, Antonio Cifariello in La bella di Roma e Renato Salvatori in La domenica della buona gente.

Sul piccolo schermo apparve per la prima volta nel 1956, nello sceneggiato L'alfiere diretto da Anton Giulio Majano, ma è nel 1959, annata chiave della sua carriera, che ottenne uno strepitoso successo di pubblico con la sua partecipazione a Canzonissima, accanto a Delia Scala, Paolo Panelli e il ballerino e coreografo statunitense Don Lurio.

In quella memorabile trasmissione creò la macchietta del "barista di Ceccano", la cui battuta tormentone “Fusse che fusse la vorta bbona” entrò nel linguaggio comune.

Riuscì persino a convincere l'amico Marcello Mastroianni, notoriamente restio ad apparire in televisione, ad esibirsi in una scenetta insieme a lui.

Usò il suo timbro di voce anche come narratore fuori campo, nel 1960, nel film di Mario Mattoli Totò, Fabrizi e i giovani d'oggi.

Manfredi convince non soltanto in parti comiche o brillanti, ma anche come attore drammatico. I personaggi che interpreta sono uomini fondamentalmente ottimisti, in possesso di una loro dignità e moralità, destinati inevitabilmente alla sconfitta ma non umiliati; grazie alle loro doti di amara ironia, sono spesso in grado di sovrastare il prepotente e ipotetico vincitore.

Tra le oltre cento pellicole della sua sterminata filmografia, vanno ricordati almeno i ruoli del rappresentante scambiato per gerarca fascista in Anni ruggenti di Luigi Zampa (1962), il cittadino distrutto da una burocrazia impietosa in Made in Italy di Nanni Loy (1965), l'amico di un editore, disilluso dalla civiltà consumistica e diventato stregone in Africa in Riusciranno i nostri eroi a ritrovare l'amico misteriosamente scomparso in Africa? di Ettore Scola (1968), il calzolaio convivente more uxorio con una donna ebrea che si rivela alla fine essere Pasquino, l'autore di invettive in rima contro il Papa nel film Nell'anno del Signore di Luigi Magni (1969), l'emigrante italiano in Svizzera costretto a tingersi i capelli di biondo durante una partita della Nazionale di calcio in Pane e cioccolata di Franco Brusati (1974), il portantino d'ospedale Antonio in C'eravamo tanto amati di Ettore Scola (1974), e il venditore abusivo di caffè sui treni Michele Abbagnano in Cafè Express di Nanni Loy (1980), a detta di molti la sua interpretazione più intensa e sofferta.

Si aggiudicò 5 Nastri d'Argento e 5 David di Donatello.

Nel 1962 debuttò dietro la macchina da presa con un pregevole cortometraggio, L'avventura di un soldato, episodio del film L'amore difficile, tratto dall'omonima novella di Italo Calvino, delicata e notevole storia sullo sbocciare di un amore tra un soldato e una vedova nello scompartimento di un treno, tutto giocato sul silenzio e sulla mimica.

La sua seconda regia è lo stupendo Per grazia ricevuta (1971), pervaso da sincera commozione, col quale si aggiudica la Palma d'Oro per la miglior opera prima al Festival di Cannes e un Nastro d'Argento per il miglior soggetto.

Ne dirigerà un terzo nel 1981, Nudo di donna, ereditandone anche il tema da Alberto Lattuada che lo iniziò, sulla crisi d'identità di un uomo che scopre una sosia perfetta della moglie dal carattere allegro e disinibito, mentre la consorte è seria e posata.

Sul palcoscenico rientrò alla fine degli anni '80 da assoluto protagonista delle commedie, da lui anche scritte e dirette, Gente di facili costumi, del 1988 e Viva gli sposi! del 1989, in seguito portati più volte in tournée anche nel decennio successivo.

Sul piccolo schermo fa il suo rientro in maniera eclatante, nel 1972, quando interpreta in maniera sensibilissima e misurata Geppetto, il padre di Pinocchio nello sceneggiato televisivo Le avventure di Pinocchio diretto da Luigi Comencini.

Interprete di un numero incalcolabile di caroselli e short pubblicitari, per 17 anni è stato testimonial fisso di una nota marca di caffé accanto alla simpatica nonna Nerina Montagnani, dove lanciò un'altra frase destinata a passare alla storia.

Dagli anni '90 alla morte interpretò numerose fiction televisive dirette perlopiù dal genero Alberto Simone e dal figlio Luca.

Sono sempre personaggi carichi di notevole umanità, il commissario Franco Amidei di Un commissario a Roma, del 1993 e soprattutto il brigadiere Nino Fogliani nella serie televisiva di grandissimo successo Linda e il brigadiere del 1997, accanto a Claudia Koll.

Molto attivo alla radio, ospite d'onore in trasmissioni di ogni genere, si è esibito, e con successo, anche come cantante: nel 1970 la sua versione del classico di Ettore Petrolini Tanto pe' canta', risalente al 1932, raggiunge le primissime posizioni della Hit Parade.

Più avanti ottengono successo anche Tarzan lo fa del 1978 e Canzone pulita, eseguita come ospite al Festival di Sanremo 1983, accompagnato da 50 bambini e di cui gli introiti ricavati dalla vendita del disco furono devoluti alla ricerca sul cancro.

Nel 1994 pubblicò la sua autobiografìa, Nudo d'attore, che ottenne un buon successo editoriale.

L'ultimo suo toccante ruolo fu quello di Galapago nel film, uscito postumo, La fine di un mistero, diretto da Miguel Hermoso. Si tratta di un'interpretazione lodatissima dalla critica: asciutta, scarna ed essenziale, quasi senza parole, fatta soltanto di sguardi fissi, che gli valse il Premio alla carriera intitolato a Pietro Bianchi.

Nel settembre 2003, subito dopo la fine delle riprese, viene colto da un collasso cardiaco.

Ricoverato in ospedale, non si riprenderà mai completamente, trascorrendo nove mesi in una continua alternanza di miglioramenti e peggioramenti.

Muore a 83 anni, il 4 giugno 2004, un anno e quattro mesi dopo Alberto Sordi.

Era sposato dal 1955 con l'ex indossatrice di moda Erminia Ferrari, dalla quale ha avuto tre figli, la produttrice Roberta, il regista Luca e Giovanna.

La quarta figlia, Tonina, è nata da una relazione con la giovane bulgara Svetlana Bogdanova che conobbe a Sofia durante le riprese di un film.

L'osservatorio astronomico di Campo Catino, con una cerimonia svoltasi il 5 febbraio 2007 presso il salone dell'Amministrazione provinciale di Frosinone, ha ribattezzato l'asteroide 2002 NJ34 col suo do Nino Manfredi, in sua memoria.

• Monastero di Santa Chiara (Napoli ha fatto un sogno), regia di Mario Sequi (1949)
• Torna a Napoli, regia di Domenico Gambino (1949)
• Anema e core, regia di Mario Mattoli (1951)
• Viva il cinema!, regia di Enzo Trapani (1952)
• La prigioniera della torre di fuoco, regia di Giorgio Walter Chili (1952)
• Ho scelto l'amore, regia di Mario Zampi (1952)
• La domenica della buona gente, regia di Anton Giulio Majano (1953)
• Ridere, ridere, ridere, episodio Al Night Club Bar Zellette, regia di Edoardo Anton (1954)
• Gli innamorati, regia di Mauro Bolognini (1955)
• Prigionieri del male, regia di Mario Costa (1955)
• Non scherzare con le donne, regia di Giuseppe Bennati (1955)
• Lo scapolo, regia di Antonio Pietrangeli (1955)
• Guardia, guardia scelta, brigadiere e maresciallo, regia di Mauro Bolognini (1956)
• Totò Peppino e la... malafemmina, regia di Camillo Mastrocinque (1956)
• Tempo di villeggiatura, regia di Antonio Racioppi e Luigi Zampa (1956)
• Susanna tutta panna, regia di Stefano Vanzina (1957)
• Camping, regia di Franco Zeffirelli (anche soggetto e sceneggiatura -1957)
• Femmine tre volte, regia di Steno (1957)
• Guardia, ladro e cameriera, regia di Steno (1958)
• Caporale di giornata, regia di Gianni Puccini (1958)
• Adorabili e bugiarde, regia di Nunzio Malasomma (1958)
• Pezzo, capopezzo e capitano, regia di Wolfgang Staudte (1958)
• Carmela è una bambola, regia di Gianni Puccini (1958)
• Venezia, la luna e tu, regia di Dino Risi (1958)
• I ragazzi dei Parioli, regia di Sergio Corbucci (1959)
• Audace colpo dei soliti ignoti, regia di Nanni Loy (1959)
• L'impiegato, regia di Gianni Puccini (anche soggetto e sceneggiatura - 1960)
• Le pillole di Ercole, regia di Luciano Salce (1960)
• Crimen, regia di Mario Camerini (1960)
• Il giudizio universale, regia di Vittorio De Sica (1961)
• A cavallo della tigre, regia di Luigi Comencini (1961)
• Il carabiniere a cavallo, regia di Carlo Lizzani (1961)
• Anni ruggenti, regia di Luigi Zampa (1962)
• I motorizzati, regia di Camillo Mastrocinque (1962)
• L'amore difficile, episodio L'avventura di un soldato, regia di Nino Manfredi (1962)
• La parmigiana, regia di Antonio Pietrangeli (1962)
• La ballata del boia (El Verdugo), regia di Luis Garcia Berlanga (1963)
• I cuori infranti, episodio E vissero felici..., regia di Gianni Puccini (1963)
• Alta infedeltà, episodio Scandaloso, regia di Franco Rossi (1963)
• Le bambole, episodio La telefonata, regia di Dino Risi (1964)
• Controsesso, episodi Cocaina di domenica di Franco Rossi e Una donna d'affari di Renato Castellani (1964)
• Questa volta parliamo di uomini, regia di Lina Wertmüller (1964)
• Il gaucho, regia di Dino Risi (1964)
• Io, io, io... e gli altri, regia di Alessandro Blasetti (1965)
• Made in Italy, regia di Nanni Loy (1965)
• Thrilling, episodio Il vittimista, regia di Ettore Scola (1965)
• I complessi, episodio Una giornata decisiva, regia di Dino Risi (1965)
• Io la conoscevo bene, regia di Antonio Pietrangeli (1965)
• Straziami ma di baci saziami, regia di Dino Risi (1966)
• Una rosa per tutti, regia di Franco Rossi (anche soggetto e sceneggiatura - 1966)
• Operazione San Gennaro, regia di Dino Risi (1966)
• Adulterio all'italiana, regia di Pasquale Festa Campanile (1966)
• Italian Secret Service, regia di Luigi Comencini (1967)
• Il padre di famiglia, regia di Nanni Loy (1967)
• Riusciranno i nostri eroi a ritrovare l'amico misteriosamente scomparso in Africa?, regia di Ettore Scola (1968)
• Nell'anno del Signore, regia di Luigi Magni (1969)
• Vedo nudo, regia di Dino Risi (1969)
• Rosolino Paternò soldato, regia di Nanni Loy (1970)
• Contestazione generale, episodio Concerto a tre pifferi, regia di Luigi Zampa (1970)
• Per grazia ricevuta, regia di Nino Manfredi (1971)
• La Betia ovvero in amore per ogni gaudenzia ci vuole sofferenza, regia di Gianfranco De Bosio (anche sceneggiatura - 1971)
• Roma bene, regia di Carlo Lizzani (1971)
• Trastevere, regia di Fausto Tozzi (1971)
• Le avventure di Pinocchio, regia di Luigi Comencini (proiettato in televisione in una versione più lunga - 1972)
• Girolimoni, il mostro di Roma, regia di Damiano Damiani (1972)
• Lo chiameremo Andrea, regia di Vittorio De Sica (1973)
• Pane e cioccolata, regia di Franco Brusati (anche soggetto e sceneggiatura - 1974)
• C'eravamo tanto amati, regia di Ettore Scola (1974)
• Attenti al buffone, regia di Alberto Bevilacqua (1975)
• Brutti, sporchi e cattivi, regia di Ettore Scola (1975)
• Basta che non si sappia in giro...!, episodi Il superiore di Luigi Magni e L'equivoco di Luigi Comencini (1976)
• Quelle strane occasioni, episodio Il cavalluccio svedese, regia di Luigi Magni (1976)
• Signore e signori, buonanotte, episodio Il Santo Soglio, regia di Luigi Magni (1976)
• In nome del Papa Re, regia di Luigi Magni (1977)
• La mazzetta, regia di Sergio Corbucci (1978)
• Cocco mio (Gros calin), regia di Jean-Pierre Rowson (1979)
• Il giocattolo, regia di Giuliano Montaldo (anche soggetto e sceneggiatura - 1979)
• Café Express, regia di Nanni Loy (1980)
• Nudo di donna, regia di Nino Manfredi (1981)
• Spaghetti House, regia di Giulio Paradisi (1982)
• Testa o croce, episodio Il figlio del beduino, regia di Nanni Loy (1982)
• Questo e quello, regia di Sergio Corbucci (1983)
• Grandi magazzini, regia di Castellano e Pipolo (1986)
• Il tenente dei carabinieri, regia di Maurizio Ponzi (1986)
• Secondo Ponzio Pilato, regia di Luigi Magni (1987)
• I picari, regia di Mario Monicelli (1987)
• Napoli-Berlino, un taxi nella notte (Helsinki-Napoli all night long), regia di Mika Kaurismaki (1988)
• In viaggio con Alberto (Alberto Express), regia di Albert Joffé (1990)
• In nome del popolo sovrano, regia di Luigi Magni (1991)
• Mima, regia di Philippe Esposito (1991)
• L'olandese volante (Der flegende Hollander), regia di Jos Stelling (1995)
• Colpo di luna, regia di Alberto Simone (1995)
• Grazie di tutto, regia di Luca Manfredi (1998)
• La carbonara, regia di Luigi Magni (1999)
• Una milanese a Roma, regia di Diego Febbraro (2001)
• Apri gli occhi e... sogna, regia di Rosario Errico (2002)
• La fine di un mistero (La luz prodigiosa), regia di Miguel Hermoso (2003)

• L'amore difficile, episodio L'avventura di un soldato (anche sceneggiatura - 1962)
• Per grazia ricevuta (anche soggetto e sceneggiatura - 1970)
• Nudo di donna (iniziato da Alberto Lattuada, anche soggetto e sceneggiatura - 1981)

• La vita di Gesù (1975)
• Julianus barát, regia di Gábor Koltay (1991)
• Un commissario a Roma, regia di Ignazio Agosta e Luca Manfredi - serie telefilm - 1992)
• Linda e il brigadiere, regia di Gianfrancesco Lazotti e Roberto Giannarelli (serie telefilm -  1997)
• Linda e il brigadiere 2, regia di Gianfrancesco Lazotti (serie telefilm - 1998)
• Dio ci ha creato gratis, regia di Angelo Antonucci (1998)
• Linda, il brigadiere e..., regia di Alberto Simone (serie telefilm - 1999)
• Meglio tardi che mai, regia di Luca Manfredi (1999)
• Una storia qualunque, regia di Alberto Simone (2000)
• Un difetto di famiglia, regia di Alberto Simone (2002)
• Chiaroscuro, regia di Tomaso Sherman (2003)
• La notte di Pasquino, regia di Luigi Magni (2003)
• Un posto tranquillo, regia di Luca Manfredi (2003)